PI3K стимулирует синтез кофермента А de novo из витамина B5.

Nature, том 608, страницы 192–198 (2022 г.) Процитировать эту статью

20 тысяч доступов

13 цитат

103 Альтметрика

Подробности о метриках

В ответ на гормоны и факторы роста сигнальная сеть фосфоинозитид-3-киназы класса I (PI3K) функционирует как основной регулятор метаболизма и роста, регулируя клеточное поглощение питательных веществ, выработку энергии, снижая выработку кофакторов и биосинтез макромолекул1. Многие из мутаций, приводящих к раку с самой высокой частотой рецидивов, в том числе в рецепторных тирозинкиназах Ras, PTEN и PI3K, патологически активируют передачу сигналов PI3K2,3. Однако наше понимание основной метаболической программы, контролируемой PI3K, почти наверняка неполное. Здесь, используя метаболомику на основе масс-спектрометрии и изотопное отслеживание, мы показываем, что передача сигналов PI3K стимулирует синтез de novo одного из наиболее важных метаболических кофакторов: кофермента А (КоА). КоА является основным носителем активированных ацильных групп в клетках4,5 и синтезируется из цистеина, АТФ и незаменимого питательного вещества витамина B5 (также известного как пантотенат)6,7. Мы идентифицируем пантотенаткиназу 2 (PANK2) и PANK4 как субстраты эффекторной киназы PI3K AKT8. Хотя известно, что PANK2 катализирует определяющую скорость первую стадию синтеза КоА, мы обнаружили, что минимально охарактеризованный, но высококонсервативный PANK49 является лимитирующим супрессором синтеза КоА благодаря своей метаболитной фосфатазной активности. Фосфорилирование PANK4 с помощью AKT снимает это подавление. В конечном счете, ось PI3K-PANK4 регулирует содержание ацетил-КоА и других ацил-КоА, а также КоА-зависимые процессы, такие как липидный метаболизм и пролиферация. Мы предполагаем, что эти регуляторные механизмы координируют поставки клеточного КоА с потребностями метаболизма и роста, управляемого гормонами/факторами роста или онкогенами.

В поисках основных компонентов метаболической программы, управляемой PI3K класса I, мы провели немеченый целевой метаболомный скрининг на основе жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) с использованием нетрансформированной линии эпителиальных клеток молочной железы человека MCF10A. . PI3K играет важную роль в росте молочной железы и является основной причиной рака молочной железы10,11. Клетки MCF10A аналогичным образом зависят от стимулируемой фактором роста передачи сигналов PI3K для роста и пролиферации. Клетки обрабатывали инсулином для резкой стимуляции передачи сигналов PI3K в присутствии или в отсутствие ингибитора PI3K (расширенные данные, рис. 1a). Помимо изменения известных метаболических путей, регулируемых PI3K1, мы заметили, что ингибирование PI3K увеличивает концентрацию пантотената, важного питательного вещества, также известного как витамин B5 (VB5). VB5 уникально используется в сочетании с цистеином и АТФ для биосинтеза кофактора CoA6,7 de novo (рис. 1а). Будучи основным переносчиком активированных ацильных групп внутри клеток, КоА играет решающую роль в различных основных метаболических процессах, включая катаболизм питательных веществ и синтез липидов4,5.

а — Путь синтеза КоА de novo. b — лечение инсулином (100 нМ) и ингибитором PI3K (GDC-0941 или GDC-0032; 2 мкМ) с одновременным мечением 13C315N1-VB5 (3 часа), которому предшествует депривация сыворотки/фактора роста (18 часов) и предварительная обработка ингибитором (15) мин) в клетках MCF10A. c — клетки MCF10A с нокаутом PIK3CA+/+ и PIK3CAp.H1047R/+, обработанные ингибитором PI3K (GDC-0941; 2 мкМ). В остальном маркировка и условия были такими, как описано в b. d, КоА, экстрагированный кислотой, и короткоцепочечный ацил-КоА с клетками и условиями, описанными в пункте b, за исключением 4-часовой обработки и маркировки. e, Мечение радиоактивным 14C-VB5 (3 часа) с клетками и условиями, в противном случае описанными в пункте b, с последующей прогонкой (1 час) в среде без VB5. Распады в минуту (DPM), нормированные по белку. f, обработка ингибитором AKT (GDC-0068, 2 мкМ) и ингибитором mTORC1 (рапамицин, 100 нМ) с одновременным мечением 13C315N1-VB5 (3 часа) клеток MCF10A, экспрессирующих индуцируемые доксициклином (Dox) HA дикого типа (WT) ) или конститутивно активный (Е17К) АКТ. Обработкам и маркировке предшествовали инкубация с доксициклином (48 часов), депривация сыворотки и факторов роста (18 часов) и предварительная обработка ингибитором (15 минут). g, обработка клеток ингибитором AKT (GDC-0068, 2 мкМ) и ингибитором ACLY (NDI-091143, 15 мкМ), мечение и условия, как описано в f. Для b–d, f и g метаболиты измеряли с помощью ЖХ–МС/МС и нормализовали по белку; меченые метаболиты (масса + 4 [М + 4]); дробное содержание составляет [M + 4]/всего. На графиках процентных изменений среднее значение крайней левой группы лечения было установлено равным 0%. Для б–ж n = 3 биологических повтора (кружки). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка. Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с критерием Тьюки; звездочки (*) указывают на значительные различия по сравнению с группами лечения, отмеченными крестиками (†), или между группами лечения, указанными в скобках (P <0,05). Иммуноблоттинг-анализ исследовал общие и фосфорилированные (p) белки.

25%) were tested for correlation to CoA levels as described above (PatternHunter, MetaboAnalyst 4.0; pattern: 3–2–1–2 for cell lines empty vector–PANK-WT–PANK4T406A–PANK4T406E; false-discovery rate < 0.1). Significantly correlated lipids with even-chain fatty acids were visualized by heat map as the average fold change relative to the row mean of each lipid./p> 20%) were visualized by heat map as the fold change relative to the average of the vector samples./p>

25%) that correlated with CoA levels between cell lines (Patternhunter, Metaboanalyst 4.0, false discovery rate < 0.1) are represented by heatmap as fold change relative to the row mean for each respective lipid species. Lipid classes altered by PANK4 T406 phosphorylation status are represented in pie charts. Relative levels of triacylglycerols in PANK4-expressing cell lines are graphed separately as fold change relative to the mean of the three PANK4-expressing samples for each given triacylglycerol. Replicate samples (○). Mean (bars). SD (error bars); n = 39 triacylglycerol species. *significant difference from treatment marked (†), one-way ANOVA with Tukey's test, (pi, 13C6-glucose labelling (16 h) of PANK4 KO AKT p.E17K/+ MCF10A cells stably expressing empty vector or PANK4-WT, grown in serum-free media with serum replacement and growth factors, followed by mass spectrometry-based lipidomics analysis. Protein immunoblots probed with indicated antibodies (left); molecular weight markers in kD (right). Since M+3 and above lipid isotopologues were enriched in labelled over unlabelled samples, the lipids for which the total signal for M+3 and above isotopologues was significantly different between vector and PANK4-WT cell lines (n = 3 biological replicates, two-sided student's t-test, false discovery rate < 0.1, fold change > 20%) were represented by heatmap as fold change relative to the average of vector control samples. Total levels and fractional abundance ((sum of ≥M+3)/total) of significantly altered labelled lipid species are also shown by heatmap. Lipid classes colour- and letter-coded (A-H). j, Diagram of labelled 13C6-glucose tracing into metabolites that generate fatty acids, glycerol backbones, and phospholipid headgroups. Polar metabolites were measured by mass spectrometry from PANK4 KO AKT p.E17K/+ MCF10A cells expressing empty vector, PANK4-WT or PANK4-D623A, and grown in serum-free media with serum replacement and growth factors. Metabolites are colour-coded by significant increase (red), no change (blue), and decrease (green) in PANK4-WT-expressing cells relative to empty-vector-expressing cells. k, Immunoblots of acid-extracted histones from PANK4 KO AKT p.E17K/+ MCF10A cells stably expressing empty vector, PANK4-WT, or PANK4-D623A, and grown in serum-free media with serum replacement and growth factors. Probed with indicated antibodies (left); molecular weight markers (right). Band intensities were quantified using ImageJ and acetyl-histone abundance was normalized to total histone abundance. Relative normalized acetyl-histone quantities are shown below each acetyl-histone band with the vector group set to 1. Representative of two independent experiments./p>

Блог

PI3K стимулирует синтез кофермента А de novo из витамина B5.