Количественная оценка биологической фиксации азота Мо

Научные отчеты, том 12, Номер статьи: 22011 (2022) Цитировать эту статью

683 Доступа

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Биологическая фиксация азота (BNF) каноническим молибденом и дополнительными изоформами ванадия и нитрогеназы, содержащими только железо, является основным естественным источником вновь фиксированного азота. Понимание контроля над глобальным круговоротом азота требует знания изоформы, ответственной за BNF в окружающей среде. Анализ изотопного восстановления ацетилена (ISARA), который измеряет фракционирование стабильных изотопов углерода (13C/12C) между этиленом и ацетиленом в анализах восстановления ацетилена, является одним из немногих методов, которые могут количественно оценить потоки BNF, специфичные для изоформ. Применение классической ISARA было сложной задачей, поскольку активность BNF в окружающей среде часто слишком низка, чтобы генерировать достаточное количество этилена для изотопного анализа. Здесь мы описываем высокочувствительный метод измерения этилена δ13C путем поточного сочетания предварительного концентрирования этилена с масс-спектрометрией газовой хроматографии-сгорания-изотопов (EPCon-GC-C-IRMS). Потребность в этилене в пробах с 10% об.% ацетилена снижается с > 500 до ~ 20 ppmv (~ 2 ppmv с предварительным автономным удалением ацетилена). Чтобы повысить надежность за счет уменьшения ошибок калибровки, мутанты Azotobacter vinelandii с одной изоформой нитрогеназы и анализы проб из окружающей среды полагаются на общий источник ацетилена для производства этилена. Применение метода ISARA с низкой активностью BNF (LISARA) к почвам с низкой азотфиксирующей активностью, листовому опаду, гниющей древесине, криптогамам и термитам указывает на наличие комплементарного BNF в большинстве типов образцов, что требует дополнительных исследований BNF, специфичных для изоформ.

Азот (N) фундаментально устанавливает пределы биологической продуктивности, вероятно, ограничивая реакцию естественных экосистем на глобальные изменения окружающей среды1,2,3. Биологическая фиксация азота (БНФ), прокариотический процесс, который превращает атмосферный диазот (N2) в аммиак, является основным биологическим источником нового биодоступного азота для глобальных и региональных балансов азота. Таким образом, он играет ключевую биогеохимическую функцию в различных экосистемах, включая тропические, умеренные и высокоширотные леса, горные травы и кустарники, а также донную среду и среду открытого океана4,5. Нитрогеназа, металлофермент, ответственный за BNF, существует в трех основных изоформах, характеризующихся наличием переходного металла в активном центре: канонической нитрогеназы и «альтернативной», или недавно названной «комплементарной», содержащей только ванадий (V) и железо ( Fe)-только нитрогеназы6,7. Нитрогеназы, содержащие только V и Fe, не зависят от Mo и содержат более распространенные микроэлементы V и Fe из земной коры вместо Mo8.

Определение вклада различных изоформ нитрогеназы в BNF окружающей среды имеет решающее значение для понимания механизмов контроля над BNF экосистемы, особенно того, как связанные биогеохимические циклы макронутриентов и биологически активных микроэлементов реагируют на антропогенные возмущения. Поскольку расчеты уровня BNF, основанные на традиционных методах (т.е. анализах восстановления ацетилена и методах естественного содержания 15N/14N), чувствительны к изоформе нитрогеназы9,10,11, неправильное приписывание изоформ нитрогеназы, активных в BNF, может изменить оценки баланса N примерно на до 50%12,13, что влияет на состояние N в экосистеме и управление ею.

Металлоспецифичность потоков BNF из окружающей среды теперь можно оценить с помощью отслеживания потока, специфичного для изоформ, с помощью анализа изотопного восстановления ацетилена (ISARA) и методов выхода этана в сочетании с анализом последовательности генов нитрогеназы6,12,13,14. Эти подходы выявили значительный вклад комплементарных нитрогеназ, содержащих только V и Fe, в неризобный BNF в различных образцах, начиная от опада мангровых зарослей Эверглейд умеренного пояса, отложений прибрежных солончаков умеренного пояса и бореальных цианолишайников12,13,15,16. Совсем недавно исследование цианолихенового BNF в градиенте питательных веществ в бореальных лесах протяженностью 600 км предоставило первые доказательства в масштабе экосистемы роли V-нитрогеназы в поддержании поступления BNF в условиях ограниченного содержания молибдена13, подтвердив давнюю гипотезу о «резервном» роль комплементарных нитрогеназ, первоначально предложенная лабораторными исследованиями17. Кроме того, низкие соотношения активности восстановления ацетилена и азота (т.е. отношения R), что указывает на наличие дополнительного BNF, наблюдались в почве умеренного пояса9, бореальном мхе11,18 и гниющей древесине19. Кроме того, комплементарные и неохарактеризованные гены нитрогеназы были обнаружены в древесной мульче20, задних кишках термитов21, почве9, мхе22 и цианолишайниках23,24. Эти исследования наряду с накоплением примеров Mo-ограниченного BNF в бореальных18,25,26, умеренных и тропических лесных биомах27,28,29,30,31,32,33 позволяют предположить, что Mo-независимый, дополнительный BNF может играть глобальную роль. Тем не менее, количественная оценка Mo-независимых показателей BNF в образцах окружающей среды, которые часто имеют низкую активность BNF, является сложной задачей, поскольку наиболее надежный метод дополнительного определения BNF, ISARA12, требует гораздо более высоких выходов этилена, чем обычно наблюдается (например, почва, мох и др.). Листовой опад обычно генерирует <300 ppmv этилена в течение 1–2 дней инкубации с использованием анализа восстановления ацетилена). Более широкое изучение дополнительных BNF и средств их контроля в важных экосистемах требует методологических усовершенствований ISARA.

500 ppmv). Secondly, acetylene measurements (δ13Cacetylene) often have large uncertainties due to peak tailing and memory effects, which necessitates frequent GC column conditioning (i.e., a brief increase of temperature to remove water, acetylene, and any other analytes accumulated on the column) and combustion reactor oxidations in which pure O2 is flushed into the reactor at high temperature to regenerate the reactor's oxidative capacity. Finally, ethylene and acetylene isotope measurements are calibrated to the VPDB international carbon isotope reference scale using methane isotope standards because no ethylene standards with NIST traceable δ13C values exist. Deviations in chemical behavior between the methane standard and target analytes, ethylene and acetylene, during chromatographic separation and combustion can lead to biases during drift correction along and across multiple sample runs comprised of replicate measurements. The classical ISARA method is thus relatively time-consuming and limited to samples with high BNF activity./p> 500 ppmv) in 10% v/v acetylene were manually injected into a Thermo Scientific Trace GC Ultra-Isolink with an Agilent HP-PLOT/Q capillary GC column (30 m, i.d. = 0.32 mm, f.t. = 20 μm) and a combustion reactor connected to a Thermo Scientific Delta V Plus isotope ratio mass spectrometer (GC-C-IRMS; Fig. 1a). Modifications include the replacement of silver ferrules in the GC oven with Valcon polymide (graphite reinforced polymer) ferrules to limit memory effects from acetylene. The combustion reactor was oxidized with pure oxygen for 1 h before each run and brief (15 min) seed oxidations were performed between measurement batches (i.e., required every ~ 6–8 ethylene injections, ~ 4–6 acetylene injections) to regenerate reactor oxidation capacity and minimize drift of δ13C values. See Supplementary Table S1a online for additional instrument settings./p> 5000 ppmv (i.e., 5% of acetylene concentration), δ13Cethylene was also corrected for Rayleigh fractionation12,43./p> 100% (i.e., 100% FeNase is equivalent to ~ 140% VNase; Supplementary Table S4). Estimated uncertainty on the %FeNase scale is at most ~ 20%./p>

23.6 nmol C. The larger volume allowance of the EPCon autosampler (20 mL) relative to the GC-C-IRMS sample inlet port (≤ 1 mL) and increased sensitivity enables measurement of gases with ≥ 0.7 ppmv ethylene in the absence of background acetylene. The minimum ethylene concentration for samples with a background of 10% v/v acetylene (typical ARA samples) is 9 ppmv, or 2 ppmv if background acetylene is removed by chemical precipitation prior to EPCon analyses. Conservatively, minimum working ethylene concentrations for ARA samples are 500 ppmv (direct injection), 20 ppmv (EPCon-GC-C-IRMS), and 5 ppmv (chemical precipitation + EPCon-GC-C-IRMS). The lower sensitivity of the direct injection GC-C-IRMS method is partly due to the necessary use of a high split-ratio within the sample injector port (40:1 – the proportion of sample and He carrier gas flow that is vented from the injection port relative to the proportion that enters the GC column) to fully resolve ethylene (~ a few to several hundred ppmv) and acetylene (~ 100,000 ppmv) peaks with our capillary GC column./p> 5 V) apparent during δ13Cethylene analyses exacerbated peak tailing problems, causing decreased δ13Cethylene precision (by as much as 5‰). GC column and combustion reactor reconditioning was required when excess acetylene was inadvertently introduced into the GC-C-IRMS (e.g., incomplete venting within EPCon)./p> 160% in the %VNase scale and > 120% in the %FeNase scale must be strongly influenced by processes unrelated to BNF (e.g. natural endogenous ethylene cycling—production or consumption, gas leakage from stoppers). Non-BNF related fractionation may explain the > 160% VNase values observed for certain samples of litter (n = 1), moss (n = 1), soil (n = 4), decayed wood (n = 2)./p> 500 ppmv and the requirement for δ13Cacetylene measurements. Further, the offline precipitation step to completely remove acetylene from ARA sample headspace would enable any microbiology or wet-chemistry lab to outsource ISARA analyses of ethylene from sample and single nitrogenase calibration ARAs run with the same source acetylene to other stable isotope analytical laboratories for δ13Cethylene measurements. We note that the comparability of absolute δ13C values across research groups may vary and be difficult to assess as multiple factors (e.g., type of GC column and oxidation reactor state) can influence absolute δ13C values. This makes the simultaneous analyses of single nitrogenase calibration ARAs and environmental samples particularly important./p> 5% of the ARA produced ethylene concentration for a given sample type and location) in 12 out of 93 "no acetylene added" control samples. All 12 samples that contained endogenous ethylene were incubated for 290 to 300 h (27 samples were incubated for that long). Another batch of 27 samples incubated for 165 to 175 h did not show signs of endogenous ethylene production. Acetylene has been reported to inhibit ethylene oxidation, thus "no acetylene added" control samples might not be sufficient to assess endogenous ethylene production in ARAs with very low ethylene yield (< 20 ppmv)50. Thus, we recommend incubating samples for ideally less than 60 h when conducting an ISARA or LISARA surveys. Overall, the low endogenous ethylene production rate from our samples during incubations (Supplementary Table S3), and the similarity among isotopic signatures obtained for each sample type over four sites, 2 years, and various incubation times (2–300 h) indicates that natural ethylene cycling has minimal influence on our reported results./p>

Блог

Количественная оценка биологической фиксации азота Мо