Вирус

Том 13 научных докладов, номер статьи: 4101 (2023) Цитировать эту статью

771 Доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Экспрессия и очистка миозина важны для понимания механизмов нормального функционирования и изменений, вызванных мутациями. Последнее особенно важно для миозина II поперечнополосатых мышц, мутации которого вызывают ряд изнурительных заболеваний. Однако тяжелую цепь этого миозина сложно экспрессировать, и стандартный протокол с использованием клеток C2C12 основан на вирусной инфекции. Это требует много времени и труда и связано с требованиями инфраструктуры и биологическими опасностями, ограничивая широкое использование и препятствуя быстрому образованию широкого спектра мутаций. Мы здесь разрабатываем безвирусный метод решения этих проблем. Мы используем эту систему для трансфекции клеток C2C12 моторным доменом тяжелой цепи сердечного миозина человека. После оптимизации условий трансфекции, культивирования и сбора клеток мы функционально охарактеризовали экспрессированный белок, очищенный совместно с незаменимыми и регуляторными легкими цепями мыши. Скорость скольжения (1,5–1,7 мкм/с; 25 °C) в анализе подвижности in vitro, а также максимальная актин-активируемая каталитическая активность (kcat; 8–9 с-1) и концентрация актина для половины максимальной активности (KATPase; 70). –80 мкМ) были аналогичны тем, которые были обнаружены ранее при использовании вирусной инфекции. Результаты должны позволить проводить новые типы исследований, например, скрининг широкого спектра мутаций, которые будут выбраны для дальнейшей характеристики.

Миозины — это молекулярные моторы, которые развивают силу и движение путем взаимодействия с актиновыми нитями в циклическом процессе, управляемом обменом АТФ. Этот процесс является основой для множества важных функций, таких как сокращение мышц, подвижность/развитие силы немышечных клеток, внутриклеточный транспорт грузов и передача сигналов клеткам1. Недавно в суперсемействе миозинов было идентифицировано до 79 классов2. Все они построены вокруг тяжелой цепи миозина (MHC; ~ 90–250 кДа) с сайтом связывания актина, каталитическим сайтом АТФазы и другими элементами, важными для двигательной функции, а также для формирования филаментов и связывания грузов. Кроме того, к каждой тяжелой цепи присоединены легкие цепи, выполняющие стабилизирующую, модулирующую и регуляторную роль. Для понимания основных механизмов двигательной функции миозина, а также для детального изучения мутаций, вызывающих заболевания, важно иметь возможность экспрессировать и очищать все упомянутые белковые компоненты.

Наиболее используемая система экспрессии и очистки белков использует E. coli в качестве хозяина для экспрессии, что приводит к высоким выходам очистки (если продукт экспрессии растворим), а также к эффективности труда и затрат3. Однако в прокариотической системе отсутствует полноценный клеточный механизм, обеспечивающий соответствующую укладку и посттрансляционную модификацию эукариотических белков. В то время как экспрессия и очистка функциональных легких цепей миозина возможна с использованием E. coli, тяжелые цепи миозина (MHC) не могут быть получены в функциональной форме с использованием этой системы4. Поэтому было разработано множество эукариотических систем экспрессии и очистки на основе Dictyostelium5,6,7, Drosophila melanogaster8, клеток насекомых9,10,11,12,13,14 и клеток млекопитающих15,16. Хотя эти системы хорошо работают для производства различных классов MHC, они имели ограниченный успех с миозинами поперечнополосатых мышц позвоночных17,18,19, вероятно, из-за неспособности включить весь механизм сворачивания белков мышечных клеток. Хотя в ряде работ UNC-45 идентифицируется как шаперон, участвующий в сворачивании миозина и сборке саркомера20,21,22,23,24, по-видимому, здесь участвуют и другие факторы, такие как Hsp70/Hsp9025 и шаперонин26. В соответствии с этой точкой зрения Winkelmann и коллеги представили доказательства того, что соответствующее сворачивание миозинов поперечнополосатых мышц в полностью функциональную форму происходит только в дифференцированной мышечной среде, т.е. в мышечных миотрубках27,28,29. Основываясь на этой идее, мышиные миобласты C2C12, которые дифференцируются в мышечные трубочки, были введены в качестве предпочтительной линии экспрессирующих клеток-хозяев27. Миобласты трансфицировали плазмидами, несущими MHC скелетных мышц куриного эмбриона под промотором, что обеспечивает начало экспрессии MHC только после дифференцировки в мышечные трубочки. Выход очистки был достаточен для оценки функции миозина на основе активности актин-активируемой АТФазы. Создание стабильных клеточных линий27 в этой ранней версии системы экспрессии и очистки на основе C2C12 («система на основе C2C12» отсюда) обеспечивает относительно высокие результаты очистки с эффективным по времени и затратам рабочим процессом, исключающим циклы трансфекции. Однако развитие стабильной клеточной линии может занять до 12 месяцев30 и не будет лучшим подходом для изучения нескольких различных конструкций (например, точечных мутаций) конкретного миозина. Напротив, временная экспрессия дает преимущество короткого времени разработки и быстрого оборота30. Таким образом, система на основе C2C12 была позже модифицирована с использованием транзиторной экспрессии аденовируса для введения и изучения влияния точечных мутаций миозина, связанных с гипертрофическими кардиомиопатиями31. Та же самая система была дополнительно оптимизирована Resnicow et al.32, чтобы обеспечить производство достаточных количеств MHC для транзиентного кинетического анализа рекомбинантных изоформ скелетного и сердечного миозина человека33,34,35. Следует отметить, что в этих исследованиях была достигнута значительно более высокая активность АТФазы как для дикого типа (WT), так и для мутантного β-сердечного миозина, чем в предыдущем отчете19, где мутанты β-кардиального миозина человека были экспрессированы и очищены из клеток насекомых. В настоящее время инфицирование мышечных трубок C2C12 аденовирусом позволяет производить достаточное количество правильно свернутых и функциональных миозинов поперечнополосатых мышц (S1 и HMM-подобных конструкций) для критически важных функциональных исследований, среди прочего, для анализа подвижности in vitro и кинетики временных биохимических растворов34,36.